基因组助力Lr30的克隆

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小麦是全球重要的粮食作物，为人类供给首要的卡路里和蛋白质来历。但是，多种病害严重威胁着小麦的稳产高产。由小麦秆锈菌（Puccinia triticina Eriksson, Pt）引起的小麦叶锈病是全球小麦出产中最具破坏性的真菌病害之一。该病害散布广泛，在适合条件下可导致感病种类大幅减产。跟着全球气候变暖和病原菌毒性变异的加重，叶锈病的发生规模显着扩展，对全球小麦安全构成了严峻应战。培养和栽培抗病种类被认为是操控小麦叶锈病最经济、有用和环境友好的战略。迄今为止，已在小麦及其近缘种中判定并命名了超越80个叶锈病抗性（Lr）基因。但是，由于小麦基因组巨大且杂乱，现在仅有少量Lr基因被成功克隆。克隆新的Lr基因关于深化了解小麦抗病机制、开发分子符号辅佐育种、创制耐久抗性种类（例如经过基因聚合或构建多基因表达盒）具有重要意义。

北京大学现代农业研讨院/潍坊现代农业山东省试验室的Shisheng Chen、Baoxing Song以及河北农业大学的Xiaodong Wang团队在预印本渠道Research Square上宣布了题为“Genome-assisted identification of wheat leaf rust resistance gene Lr30 (synonym Lr.ace-4A)”的研讨论文，该研讨经过结合高质量基因组拼装、诱变育种和转录组测序技能，成功克隆了四倍体硬粒小麦（Triticum turgidum ssp. durum）地方种类PI 192051中的叶锈病抗性基因Lr.ace-4A。研讨证明，Lr.ace-4A与从前在六倍体普通小麦中判定的Lr30基由于同一个基因。该基因编码一个非典型的、包含串联NB-ARC结构域的NLR（核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复序列）免疫受体蛋白。功用验证试验标明，Lr30是介导小麦对叶锈病发生抗性的必要且充分条件。风趣的是，Lr30在四倍体小麦中体现出近乎免疫的强抗性，但在六倍体小麦布景下的抗性水平则有所削弱。研讨还发现，两个要害的氨基酸多态性位点区别了Lr30的抗病与感病单倍型，这两个位点的变异对基因功用至关重要。该研讨不只阐明晰Lr30的分子特性和作用机制，还为其在小麦育种中的使用奠定了根底。

首要研讨成果介绍

硬粒小麦地方种类PI 192051体现出对多个叶锈菌小种的广谱抗性

研讨首要评价了葡萄牙硬粒小麦地方种类PI 192051对搜集自我国的8个不同生理小种（Pt pathotypes）的抗性反响。成果显现，PI 192051的麦苗对一切测验小种均体现出高水平抗性（抗病等级'R'），而对照种类Rusty则体现为高度感病（感病等级'S'）（图1a）。当用PHQS小种接种时，感病种类Rusty在接种后6天（dpi）即呈现显着的铁锈色孢子堆，而PI 192051则体现出典型的过敏性反响（Hypersensitive Response, HR），病斑处呈现坏死（图1b）。经过WGA-FITC染色调查真菌在叶片内的成长状况发现，尽管病原菌能够在PI 192051叶片内构成吸器，但其后续的菌丝扩展遭到显着按捺；比较之下，在Rusty叶片中，菌丝则广泛延伸（图1c）。定量剖析标明，在接种后的不一起刻点（2, 4, 6, 8 dpi），PI 192051叶片中的均匀真菌侵染面积显着小于Rusty（P < 0.001）（图1d）。这些成果证明PI 192051是一个优秀的叶锈病抗性资源。

图1

使用遗传图谱将Lr.ace-4A定位到4A染色体重组按捺区域

从前的研讨已将Lr.ace-4A定位到PI 192051的4A染色体着丝粒区域一个约4.0 cM的区间内。本研讨使用PI 192051与感病种类Rusty构建的F2集体（286个单株）进行遗传剖析。成果显现抗感别离比约为1:3，契合单个隐性基因遗传的预期（弥补图1a）。但是，使用PI 192051与由其诱变发生的感病骤变体m1构建的F2集体（315个单株）进行剖析，抗感别离比约为3:1，契合单个显性基因遗传的预期（弥补图1b）。这种显隐性联系的反转现象在小麦抗病基因中偶有报导。经过开发新的分子符号，研讨者将Lr.ace-4A的定位区间进一步缩小。在两个集体中，符号pku1280到pku0332（在Svevo参阅基因组v1.0上跨度约162.15 Mb至519.32 Mb）均与Lr.ace-4A彻底连锁（弥补图2b-d）。这标明该基因坐落一个较大的重组按捺区域，这一般与着丝粒区域有关。细胞学剖析排除了外源基因进入或染色体倒位的或许性（弥补图3），承认了该基因坐落着丝粒区域。

高质量基因组拼装助力Lr.ace-4A的判定

为了克隆Lr.ace-4A，研讨团队对PI 192051进行了高质量的基因组测序和拼装。使用PacBio HiFi测序和Hi-C技能，构建了一个巨细为10.51 Gb的染色体等级基因组图谱，其Scaffold N50到达749.44 Mb，Contig N50到达42.53 Mb，显着优于已宣布的硬粒小麦Svevo和野生二粒小麦Zavitan的基因组（图2a, 2b；弥补表5, 6）。拼装质量评价（LAI、QA、BUSCO）均显现其高度接连和完好。基因组共注释了65,860个蛋白质编码基因。比较基因组学剖析显现PI 192051与其它四倍体和六倍体小麦基因组间存在杰出的共线性联系（图2c）。对四倍体小麦集体的重测序数据剖析发现，在Lr.ace-4A地点的4A染色体重组按捺区域（约150 Mb至530 Mb），遗传变异显着削减（弥补图4），这契合着丝粒区域低重组的特性。

图2

随后，研讨者对PI 192051种子进行EMS诱变处理，挑选到7个独立的、对PHQS小种体现感病的M2/M3骤变体家系（图3a）。对这7个感病骤变体进行RNA-seq测序，并将读段比对到PI 192051参阅基因组上。在Lr.ace-4A候选区域内，发现一切7个骤变体都在同一个NLR基因（PI192051.r1.4AG0210600）上发生了EMS诱导的典型的G/C到A/T的点骤变（图3b, 3c；弥补图5）。该基因坐落Svevo基因组的513.5 Mb处，与遗传定位成果一起。该基因包含3个外显子和2个内含子，编码一个包含1174个氨基酸的非典型NLR蛋白，其结构域特征为N端Coiled-Coil (CC)结构域、两个串联的NB-ARC结构域和一个C端LRR结构域（CC-NB-NB-LRR）（图3d）。RACE试验承认了其5'和3'非翻译区（UTR）的长度（弥补图6）。这些成果一起指向PI192051.r1.4AG0210600即为Lr.ace-4A基因。

图3

基因修改和转基因互补验证Lr.ace-4A的功用

为了终究承认Lr.ace-4A的功用，研讨者采用了基因修改和转基因互补两种战略。首要，使用优化的CRISPR/Cas9体系（交融Cas9-Trex2和GRF4-GIF1蛋白）对PI 192051中的Lr.ace-4A基因进行敲除。规划了特异性靶向该基因第二外显子的gRNA（图4a），并经过生物信息学剖析承认无潜在脱靶位点。成功取得了32个基因修改阳性的T0代植株（修改功率82.1%）（弥补图7）。选取了两个纯合修改的T0代植株（T0KO-1和T0KO-2，别离为1bp刺进和1bp缺失）进行后续剖析（图4a）。这两个敲除株系的T1代子孙均对PHQS小种体现为感病，而野生型PI 192051则坚持抗病（图4b）。这证明Lr.ace-4A是PI 192051抗叶锈病所必需的。

接着，研讨者将包含Lr.ace-4A完好编码区、内含子以及上下游调控序列的9.3 kb基因组片段，经过农杆菌介导转化到感病的EMS骤变体m1中。取得了25个独立的T0代转基因植株，PCR和qRT-PCR剖析承认了转基因的整合和表达（弥补图8a）。一切带着该转基因片段的T0和T1代植株均康复了对PHQS小种的强抗性，而未转化的m1对照则体现感病（图4d；弥补图8b）。这证明Lr.ace-4A基因足以赋予小麦叶锈病抗性。结合遗传定位、诱变挑选和功用验证成果，清晰PI192051.r1.4AG0210600便是Lr.ace-4A。

图4

Lr.ace-4A与Lr30为同一基因，但在六倍体小麦中抗性削弱**

Lr30是现在仅有一个定坐落普通小麦4AL染色体臂上的Lr基因。其在GrainGenes数据库中的定位区间与本研讨中Lr.ace-4A的方位高度重合。对Lr30单基因系RL6049中相应区段进行测序，发现其序列与PI 192051中的Lr.ace-4A彻底一起。但是，文献报导和本研讨均调查到，Lr30（如RL6049）仅体现出中等程度的抗性（Infection Types, ITs = 1-2）（弥补图9），显着低于Lr.ace-4A在四倍体PI 192051中的近免疫水平（IT = 0;）。研讨者估测Lr.ace-4A/Lr30在六倍体小麦布景下的抗性功率或许下降。

为验证此假定，将来历于PI 192051的9.3 kb Lr.ace-4A基因组片段转化到感病的六倍体小麦种类Fielder中（图5a）。大部分T0代转基因植株（如T0C652-3, T0C652-10）及其T1代（图5b；弥补图11）均体现出与RL6049相似的中等抗性水平，而Fielder对照则彻底感病。此外，将PI 192051的Lr.ace-4A基因经过回交导入我国普通小麦种类扬麦21（YM21）中，取得的BC2F3纯合株系相同体现出中等抗性（弥补图12）。这些成果证明了Lr.ace-4A与Lr30是同一个基因，而且其在六倍体布景下的抗性效应的确有所削弱。

图5

风趣的是，在Fielder转基因集体中，部分转基因事情（如T1C652-12, T1C652-27）由于转录本表达水平较高（弥补图10），体现出更强的抗性，挨近PI 192051的水平（图5b, 弥补图11）。这暗示抗性水平或许与基因拷贝数或表达量有关。为了进一步验证，研讨者构建了由玉米泛素（UBI）启动子驱动的Lr30过表达载体（图5c），并转化到Fielder中。过表达转基因株系的T0和T1代（图5d；弥补图14）均体现出强抗性，且转录本水平显着高于对照（弥补图13）。选取高表达的转基因株系（T1C652-12, T1C652-27）测验其对5个对Fielder强毒的小种的抗性，成果显现它们对一切测验小种均体现出强抗性（图6a），标明转基因Lr30能够仿制天然基因的抗谱。

图6

单倍型剖析提醒要害功用位点并开发确诊符号

为了解Lr30的等位变异状况，研讨者对来自多个已宣布的小麦基因组以及59份接种PHQS小种后体现感病的二粒小麦（T. dicoccon）材猜中的Lr30同源基因编码区进行了测序和比对剖析。成果发现，在这些材猜中均未找到抗病的Lr30单倍型（Hap1）。共判定出7种感病单倍型（Hap2-Hap8）（弥补图15；弥补表7）。抗病单倍型Hap1（Lr30）与其它7种感病单倍型比较，存在2-7个氨基酸差异。其间，有两个cDNA多态性位点（G1597A 和 C1984T），对应着第533位谷氨酸变为赖氨酸（E533K）和第662位精氨酸变为半胱氨酸（R662C），能够将抗病的Lr30与一切已知的感病单倍型区别隔（弥补图15）。研讨者在一个包含约1000份小麦种质资源的外显子测序数据库中发现，仅有一个品系PI 619381一起带着1597G和1984C这两个等位基因，而且该品系在接种PHQS小种后体现出与RL6049相似的抗性反响（弥补图16）。这标明E533K和R662C这两个氨基酸替换很或许是Lr30发挥抗病功用的要害。

为了验证这两个位点的功用重要性，研讨者经过定点骤变技能，别离构建了仅包含E533K（Lr30533K）或R662C（Lr30662C）单个骤变的9.3 kb基因组片段表达载体，并转化到Fielder中。成果显现，无论是带着Lr30533K仍是Lr30662C的T0和T1代转基因植株，均对PHQS小种体现为彻底感病（图6b, 6c；弥补图17），而表达原始Lr30片段的转基因植株则体现抗性（图5a, 5b）。这有力地证明晰E533K和R662C这两个天然变异关于Lr30的抗病功用都是必需的。根据这两个要害SNP位点，研讨者开发了一个显性分子符号Lr30MAS-47FR（弥补数据1；弥补图15），该符号能在54°C退火条件下特异扩增出带着Lr30基因的材猜中的916 bp片段（弥补图18）。在对包含158份普通小麦、82份四倍体小麦和69份一粒小麦的共309份种质资源进行检测后，该符号仅在已知的Lr30带着者PI 192051、RL6049和PI 619381中扩增出方针条带（弥补表8），显现出杰出的特异性和使用潜力。

Lr30蛋白的特性剖析

qRT-PCR剖析标明，在接种叶锈菌后1至4天，PI 192051中Lr30基因的表达水平显着上调（图7a），阐明该基因的表达遭到病原菌侵染的诱导。比较六倍体RL6049和四倍体PI 192051中Lr30的根底表达水平，未发现显着差异（弥补图19）。体系发育剖析显现，Lr30与已知的禾本科NLR蛋白联系较远，与水稻的Pib基因亲缘联系相对最近，但序列相似性低于38.7%（弥补图20）。使用GFP交融蛋白技能，在本生烟草（N. benthamiana）叶片和小麦原生质体中调查到，Lr30蛋白一起定坐落细胞质和细胞核（图7b, 7c；弥补图21）。在烟草叶片中瞬时表达Lr30全长蛋白或其独自的结构域（CC, NB, LRR）均不会像阳性对照BAX那样诱导显着的细胞逝世或黄化（图7d）。使用AlphaFold2和AlphaFold-Multimer进行的蛋白质结构猜测显现，Lr30的CC结构域以及包含两个NB和LRR的结构域（NB-NB-LRR）均或许构成五聚体（pentamer）的抗病小体（resistosome）结构（弥补图22）。风趣的是，两个要害的功用性氨基酸位点中，R662（在抗病型中为C）坐落猜测的五聚体界面内部，而E533（在抗病型中为K）则坐落猜测的抗病小体外部外表（图7e）。

图7

全文总结与展望

本研讨成功地使用高质量基因组拼装和EMS诱变集体相结合的战略，克服了在小麦着丝粒邻近低重组区域克隆基因的困难，判定并克隆了来历于四倍体硬粒小麦PI 192051的叶锈病抗性基因Lr.ace-4A。研讨确凿地证明晰Lr.ace-4A与从前在六倍体普通小麦中发现的Lr30基由于同一个基因，然后澄清了长期以来关于这两个基因联系的疑问。Lr30编码一个一起的、包含串联NB-ARC结构域的CC-NB-NB-LRR型免疫受体。

研讨提醒了Lr30基因作用的一个重要特性：其在四倍体小麦中供给近乎免疫的强抗性，但在六倍体小麦布景下抗性作用则显着削弱。尽管过表达Lr30能够在六倍体中康复强抗性，但这种现象提示六倍体基因组中或许存在按捺或润饰Lr30功用的因子，这与其它一些从低倍体转移到高倍体小麦后抗性削弱的基因（如Sr21, Pm8）状况相似。进一步判定这些或许的按捺因子将有助于了解小麦杂乱的基因调控网络，并或许为改进Lr30在普通小麦中的使用作用供给途径。

尤为重要的是，研讨经过单倍型剖析和功用验证，发现了两个区别抗病与感病Lr30单倍型的要害氨基酸多态性位点（E533K和R662C），证明这两个天然变异关于Lr30的抗病功用缺一不可。这一发现不只加深了对NLR蛋白功用位点的了解（特别是关于这种非典型NLR），也暗示了Lr30的抗病功用骨架或许广泛存在于小麦种质资源中。跟着基因修改技能（尤其是碱基修改）的飞速发展，未来或许能够经过准确修改这两个要害位点，直接将感病型Lr30转化为抗病型，然后快速提高小麦种类的叶锈病抗性。

此外，本研讨发生的PI 192051高质量参阅基因组是硬粒小麦研讨的重要资源。开发的Lr30特异性分子符号将极大地便当育种家在小麦育种项目中追寻和挑选该基因。尽管Lr30在普通小麦中的天然抗性有限，但其克隆为经过基因工程手法（如多基因聚合、优化表达）来增强和使用该基因供给了或许。归纳来看，这项研讨为小麦叶锈病抗性遗传改进供给了名贵的基因资源、分子东西和理论根底。未来的研讨方向可包含：深化探求Lr30抗性在六倍体中削弱的分子机制，解析其辨认叶锈菌效应子的进程，以及使用结构生物学办法进一步验证Lr30抗病小体的结构和功用。

研讨团队与赞助

该研讨由Shisheng Chen（北京大学现代农业研讨院/潍坊现代农业山东省试验室）规划并主导，Jinwei Yang、Hongna Li（北京大学现代农业研讨院/潍坊现代农业山东省试验室）、Mengyu Li（河北农业大学）和Rui Song（北京大学现代农业研讨院/潍坊现代农业山东省试验室）等完成了首要试验。Tao Shen和Shams ur Rehman参加了EMS骤变体的挑选。Baoxing Song、Hongna Li和Dong Xu完成了基因组拼装。Guiping Wang、Lei Hua和Yanyan Liang参加了载体构建。Ming Hao进行了细胞学剖析。Aolin Jia和Lan Caixia参加了蛋白结构猜测。Lan Caixia、Xingwang Deng和Jorge Dubcovsky供给了科研支撑。Shisheng Chen、Jinwei Yang和Xiaodong Wang编撰了初稿。Shisheng Chen完成了终究稿件的编撰。Shisheng Chen、Xiaodong Wang和Baoxing Song为该研讨的一起通讯作者和项目负责人。

研讨工作得到了国家要点研制方案、山东省要点研制方案、山东省天然科学基金、国家天然科学基金、泰山学者方案、河北省天然科学基金、华北作物改进与调控国家要点试验室以及河北省科技方案等项目的赞助。部分作者（S.C., J.Y., L.H., R.S., S.L.）已就Lr30基因在小麦育种中的使用申请了我国暂时专利。

榜首作者：Shisheng Chen (北京大学现代农业研讨院/潍坊现代农业山东省试验室)

通讯作者：Shisheng Chen (shisheng.chen@pku-iaas.edu.cn; 北京大学现代农业研讨院/潍坊现代农业山东省试验室), Baoxing Song (北京大学现代农业研讨院), Xiaodong Wang (河北农业大学)。

DOI链接

https://doi.org/10.21203/rs.3.rs-6289485/v1

小麦族多组学网站：http://wheatomics.sdau.edu.cn

投稿、协作等邮箱：shengweima@icloud.com

（转自：小麦研讨联盟）

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